Y1HGOLD 酵母感受态细胞

保存条件：-80℃。

1.产品简介：

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母单杂系统用菌株，MATα型，可直接转化质粒进行筛库试验。Transformation marker为：ura3， leu2；报告基因为：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母单杂系统需要两种质粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。质粒pAbAi的筛选标志为URA，用于表达pBait-AbAi construct (1~3个bait DNA序列 重复串联后克隆到pAbAi中)；质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用 于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白 (Prey)的融合蛋白。此外AbAr与营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点，可降低酵母单杂假阳性发生的概率。Y1HGold感受态细胞经特殊工艺制作，pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DN

基因型：MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL

2.使用说明：

1).取pBait-AbAi质粒5μg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收：

2).取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的目的质粒1-3μg,Carrier DNA 10μl(95-100℃ 5min快速冰浴，重复一次)，100μl冰.上融化的Y1HGOLD感受态细胞，PEG/LiAc 500ul， 轻轻翻转混匀6-8次;

3).30℃ 水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次;

4).每支加入20ul的二甲基亚砜; (用于提高转化效率，可不做)

5).42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6- 8次;

6).12000rpm瞬时离心弃上清,每支加入1m1的YPD Plus于30℃复苏1h; (用于提高转化效率， 可不做)

7).12000rpm瞬时离心弃上清，用100ul 0.9% NaCl 重悬，涂板,30℃培养48 - 96h。

3.注意事项：

1).PEG溶液在低温环境下会析出，请于常温下完全溶解后使用。

 2).转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3).同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

 4).Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高 于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5).菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母 试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold 的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

 6).酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺 陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃， 48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可 见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm 克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆

*本试剂仅供实验室研究使用