问题1.为什么免疫后没有效价或免疫后效价低？

答：可以从这几个方面去查找原因：

（1）免疫的抗原，分子量和抗原性是否合适；分子量最好不小于25kDa;对于小分子化合物或者多肽，需要偶联载体蛋白，比如KLH,OVA或者KLH，一般首选KLH;

(2)免疫的佐剂是否合适，免疫的佐剂常用的是弗氏完全佐剂与不完全佐剂，可以试试其他的佐剂，比如水溶性佐剂；

（3）免疫程序是否合适，不同佐剂需要设计不同的免疫程序，一般免疫三次后，效价依然没有起色的话，就需要重新考虑目前的抗原设计、抗原和免疫程序问题；

（4）免疫计量问题，蛋白类抗原，免疫之前，通过SDS-PAGE确定蛋白量的问题，比其他蛋白浓度测定方法更靠谱；每种蛋白浓度测定方法都有其缺陷；

（5）免疫方式问题，免疫的时候尽可能多点，多部位，必要的时候可以配合脾脏免疫和尾静脉免疫；

（6）效价测定的问题，测免疫效价，一般采用间接ELISA法，这个方法需要搭建好ELISA测定程序，比如抗原包被的最佳浓度选择，二抗使用浓度，底物灵敏度；另外，对于不同浓度的抗原，对其效价的评价需要区别对待：对于抗原性比较较弱的，1:10000以上就是非常好的选择，对于小分子效价，1:3000也算成功。

问题2:融合后细胞不长或者融合后克隆很少？

 最重要的制约因素：血清，融合剂PEG，SP2/0状态，小鼠种系

（1）培养基和血清问题，特别是血清，市面上的血清良莠不齐，不管是什么牌子的，需要亲自做融合测试筛选，筛选到最适合融合培养的，这个工作量有点大，很多人不愿意去做；

（2）融合试剂PEG问题，这个其实是很简单的问题，可以买大牌成品的融合剂，比如Sigma P7181,也可以买大品牌的干粉自己配制，这需要实验室的实验用水比较过关；

（3）免疫所用的Balb/C小鼠，品系是否纯正，如果品系不纯正，即使融合成功，后期在亚克隆过程中，细胞株养不活后者分泌抗体能力越来越弱。

（4）HAT和HT浓度要合适，如果对于HT好HAT试剂组分浓度计算不是特别熟悉或者来源不是特别的纯正的，最好购买商业化的配制好的；自己配制的话要做细胞培养浓度测试，这个实验步骤繁琐。

（5）饲养细胞问题，传统教科书上融合后铺板需要加入饲养细胞，其实如果血清出色，并不需要添加饲养细胞，添加饲养细胞，无形中还增加了污染的可能；我可能用融合专用血清，15%-20%浓度，一个老鼠脾脏细胞与一个T75细胞培养瓶的SP2/0融合，铺板12-15块，根本不用加入饲养细胞，当然这也需要看免疫的脾脏的大小，不同的老鼠和不同免疫抗原免疫出来的脾脏的大小差异还是很大。饲养细胞的作用，是临时提供细胞因子和伴侣支持；

（6）铺板的密度问题，建议每个96孔的板孔铺总细胞数量在100000个左右为宜。

（7）细胞可能被污染。细菌污染很容易观察，培养基很快会变浑浊，培养基变得很黄，真菌污染也很容易判断，支原体污染不容易辨别和发现，可以通过试剂盒检测。

（8）已经问题：培养箱温度，湿度和CO2浓度是否合适；如果不合适，细胞可能不能很好生长；特别是大实验室，培养细胞的人很多共用一个培养箱，反复开关，CO2浓度、温度和湿度都很难保证稳定。

3.  融合后检测不到阳性克隆？

（1）      检测方案是否正确，有没有做平行的阳性对照；

（2）      检测系统与培养液里面的成分干扰了；

（3）      融合的集落太小，分泌的抗体太少；

（4）      长起来的集落是假融合（HAT失活）细胞，或者不正常的集落；

4.  融合后检测是满板的阳性？

（1）建立有效的检测方法，上文已经提及，检测时同时设置平行的阴阳性对照孔；

（2）培养基富营养化，未融合的细胞存活时间太长，分泌大量阳性抗体在孔里；解决方案：置换培养液之后再次检测；

（3）每个细胞板孔细胞集落太多，解决方案：稀释转板培养之后，等生长起来再次检测；

5.融合后的细胞生长很慢？

（1）培养液，特别是血清不太适合细胞生长；一定要选用优质适合杂交瘤生长的血清；

（2）培养耗材对细胞生长不太友好；

（3）细胞量比较少的时候，比如亚克的时候，可以适当添加饲养细胞或者杂交瘤克隆生长因子；

（4）细胞存在污染，比如支原体污染，有的甚至导致细胞死亡；

（5）确实有个别细胞对于营养的需求比较特殊，不容易生长或者生长缓慢，但是分泌抗体能力很强，一个孔里有几个细胞就检测到超强的信号。

6.  经过几轮亚克，阳性的克隆变成阴性？

（1）细胞株不纯，不分泌的细胞占据优势，亚克隆的过程中，阳性细胞没有分种到细胞孔里，或者及时分种到了，克隆没有长起来，自然没有筛选到阳性克隆；

（2）细胞株不稳定，容易发生染色体丢失；所以再细胞传代的过程中需要经常做一下亚克隆；

（3）细胞生长的环境不友好，比如，把细胞培养老了，半死不活的再救回来，可能很多细胞已经变性了；

（4）细胞被污染了，也很容易不再分泌抗体，最典型的就是支原体污染；

7. 为什么亚克隆长不出克隆？

（1）培养基不给力，加点杂交瘤细胞生长因子加入适量的饲养细胞（每孔100000个）

（2）用于亚克隆的母细胞状态不好；

（3)亚克隆时，细胞计数不准或者计算错误；

（4）细胞被污染了，最典型的就是支原体污染；

（5）使用HAT培养的细胞，在亚克隆时候培养液里要添加HT，原因是上一步骤HAT中的A残留，如果不添加HT，会使细胞致死；

（6）其他的硬件问题，与上面的内容相同。

8. 杂交瘤注射到小鼠腹腔不产腹水，只长实体瘤或者产生的腹水没有效价？

（1）小鼠种系不纯，容易不产腹水或者产生的腹水没有效价

（2）致敏剂不太好，或者使用量不够，每只老鼠可以打0.6-0.8ml,隔一周再打一次，两次致敏以后，再注射杂交瘤细胞；

（3）注射腹腔内的细胞量不够，每次每只老鼠注射10^5-10^6个细胞，用灭菌的PBS或者不完全培养基悬浮，体积0.5-1ml

(4)产生过多实体瘤的原因，可能是在主色的时候，刺伤了腹腔皮下或肌肉或者肠道，没有将细胞充分注射到腹腔内；手法很重要；

（5）杂交瘤所产生的抗体与小鼠体内的某个分子特异性结合，产生的抗体被中和，这类抗体针对的靶蛋白与小鼠自身的蛋白物质序列高度同源。

9.  杂交瘤细胞冻存复苏不活？

（1）培养液的配方和关键试剂血清和DMSO，DMSO一定要选择适合细胞培养级别的；配方含有10% DMSO，冻存液至少含有10%-50%的血清；

（2）细胞本身的原因，让细胞处于最佳状态，对数生长时期，细胞数量10^6/ml的浓度比较合适；

（3）冻存的过程中，梯度降温很重要；最简单的方法，将细胞冻存管裹在厚厚的棉花里，埋在干冰里，或者塞在液氮罐的气相过夜，第二天放到液氮里，我们用这个方法从来没有失手。

（4）解冻的过程中，调一大烧杯的热水，热水的稳定稍微高一点，41℃-42℃，不停的搅动，直到完全解冻，吸取冻存的细胞，转入到15ml离心管，再补满不完全培养基，混匀，离心，弃掉上清。细胞沉淀用完全培养基重选培养。

（5）细胞冻存的液氮罐，定期维护，补加液氮，不要液面太低或者液氮挥发完了、

10.细胞污染的挽救

细胞的污染大致可以分三类：细菌污染、真菌污染和支原体污染，还可能由不明微生物污染。

（1）细菌污染，可以加大抗生素浓度，将细胞稀释培养，抗生素浓度加到原来10倍，每隔12小时换液，反复几次；

（2）真菌污染的话，从两种抗生素加到三种抗生素比如，我们常用的抗生素是链霉素和青霉素，可以再加一个两性霉素B,或者制霉菌素；将细胞稀释培养，多次换液，坚持培养一周。

（3）支原体污染，如果轻度污染，可以试试使用60 ug/ml的泰乐菌素和10 ug/ml左右的环丙沙星交替处理；我们还新研发的支原体处理试剂，效果比较好，也是稀释培养，多次换液，坚持培养一周。

（4）利用动物免疫系统清除，将污染的细胞注射到小鼠背部或者腹腔，等实体瘤快长成的时候，再无菌超净台上取下实体瘤，再次培养。